Mikroskopia optyczna

Leksykon.

Pojęcia z zakresu mikroskopii optycznej
oraz optyki.

Mikroskop optyczny.
Mikroskop optyczny to urządzenie służące do obserwacji małych obiektów niewidocznych nieuzbrojonym okiem, bądź struktur przygotowanych wcześniej preparatów. 

Budowa mikroskopu.
Mikroskop zbudowany jest, w najprostszym ujęciu, z następujących elementów: okular, nasadka okularowa z tubusami, uchwyt rewolwerowy, obiektywy, stolik przedmiotowy, kondensor, układ oświetlenia, podstawa mikroskopu, śruby zgrubnej i dokładnej regulacji ostrości.

Podział mikroskopów optycznych.
- dolnostolikowe ( upright ), w układzie odwróconym ( odwrócone, inwerted ), stereoskopowe,
- biologiczne, metalograficzne, polaryzacyjne, specjalistyczne,
- do obserwacji w świetle: przechodzącym, odbity, przechodzącym i odbitym,
- edukacyjne, rutynowe, badawcze. 

Okular.
Okulary to soczewka, bądź częściej zespół soczewek w tubusie mikroskopu służących do zbierania i powiększania projekcji obrazu realizowanego przez obiektyw. Okulary zbierają obraz rzeczywisty z obiektywu tworząc obraz pozorny. Najczęściej stosowane są okulary o powiększeniu 10x.
Parametry związane z okularami to: powiększenie, numer pola widzenia, regulacja dioptrii. 

Obiektyw.
zespół soczewek tworzący odwrócony, rzeczywisty obraz obiektu, struktury, oglądany przez okular lub rzutowany na ekran, kliszę fotograficzną, matrycę półprzewodnikową, katodę elektronowo-optyczną itp.
Ze względu na przeznaczenie rozróżnia się obiektywy : dające obrazy powiększone lub pomniejszone. 

Parametry charakteryzujące obiektywy:
powiększenie, klasa obiektywu, apertura numeryczna, odległość robocza, realizowana technika obserwacji. 

Klasa obiektywów.
achromatyczne, planachromatyczne, semi-planapochromatyczne, apochromatyczne.

Techniki obserwacji.
Pole jasne ( BF ), pole ciemne ( DF ), kontrast fazowy ( PHC ), kontrast Hofmanna,
kontrast reliefowy ( RC ), prosta polaryzacja, kontrast interferencyjny Nomarskiego ( DIC ),
techniki fluorescencyjne - epifluorescencja.

Jasne pole.
Jest podstawową techniką obserwacji w mikroskopii optycznej. Polega na oświetleniu preparatu wiązką światła uformowaną przez kondensor i różnicy pochłaniania ( odbijania ) przez elementy preparatu światła oświetlającego. Często, gdy elementy preparatu nie są zbyt kontrastowe, wykorzystuje się technikę barwienia, bądź trawienia preparatów tzn. różnicę w przyjmowaniu barwników przez różne elementy preparatu.

Ciemne pole.
Często wykorzystywana technika - polega na oświetleniu bocznym preparatu, uzyskanym poprzez specjalnej konstrukcji kondensor, bądź układ optyczny formujący wiązkę światła niemalże równolegle do powierzchni preparatu ( wiązka światła rozproszonego ). Stąd od wypukłych elementów preparatu
( bądź wklęsłych mocno odbijających światło - lustrzanych ) odbija się szczątkowe oświetlenie wiązki wychodzącej z kondensora, a do obserwatora dociera obraz jasnych elementów na ciemnym tle.

Technikę obserwacji w ciemnym polu stosuje się do preparatów dla których barwienie jest niepożądane, bądź z jakichś powodów niemożliwe. Tecnika pola ciemnego pozwala ponadto na uzyskanie obrazu o lepszej szczegółowości.

Kontrast fazowy i reliefowy.
Polega na zastosowaniu specjalnie dopasowanych przesłon szczelinowych. Wykorzystuje się w tym przypadku wzmocnienie różnic amplitud przechodzących ( odbitych ) wiązek światła.

Technikę kontrastu fazowego wykorzystuje się wszędzie tam, gdzie poszczególne elementy preparatu nie różnią się właściwościami absorbcyjnymi, a tylko współczynnikiem załamania światła bądź, grubością.   Ma to miejsce dla preparatów obserwowanych w polu jasnym jako przeźroczyste, a w kontraście fazowym  uwidaczniającym zarysy.  Stosowany również dla preparatów przeżyciowych, gdy barwienie jest niewskazane, bądź niemożliwe, na przykład do obserwacji hodowli komórkowej, czy też osadów w moczu. Kontrast reliefowy, podobny w działaniu do kontrastu fazowego, będący rozwinięciem tej metody, służy do quasi-przestrzennej wizualizacji elementów hodowli komórkowych w naczyniach plastikowych.

Prosta polaryzacja.
Polaryzacja fali elektromagnetycznej to uporządkowanie kierunków drgań poprzecznych zmiennych pól elektrycznych i magnetycznych. Inaczej i najprościej ujmując, to wygaszenie wszystkich innych kierunków drgań rozchodzącej się fali światła oprócz jednego kierunku, któremu polaryzator umożliwia
( pozwla ) przejść przez tenże polaryzator.

Polaryzację ( polaryzator i anlizator ), jako technikę obserwacji w mikroskopii optycznej stosujemy najczęściej do obserwacji struktur krystalograficznych i ujawniania poszczególnych płaszczyzn, bądź jest przydatna do wygaszania niepożądanych refleksów podczas obserwacji, wykonywania zdjęć i analizy obrazu.

Kontrast Nomarskiego  - DIC. Kontrast interferencyjny.
Technika polega na podziale światła spolaryzowanego przez pryzmat na dwie wiązki i wykorzystanie w ten sposób efektu oświetlenia preparatu przez wiązkę normalną oraz przesunięta ( opóźnioną w czasie ).

Efektem zastosowania tej metody jest uzyskanie obrazu quasi-przestrzennego. W technice Nomarskiego wykorzystuje się polaryzatory oraz specjalnej konstrukcji pryzmaty Wolstona ( zmodyfikowane pryzmaty Nicola ). Zastosowanie wszędzie tam, gdzie wskazane jest ujawnienie morfologii powierzchni preparatu i obiektów.

Techniki fluorescencyjne.
Fluorescencja to proces oświetlania preparatu posiadającego zdolność autofluorescencji, bądź z wykorzystaniem fluorochromów, silną wiązką światła w ograniczonym zakresie jego widma. Stosujemy oświetlenie z wykorzystaniem palnika  rtęciowego, ksenonowego, bądź coraz częściej halogenkowego. Nieodłączym elementem zestawu są filtry: wzbudzający i odcinający oraz tzw. lustro dichroiczne. Epifluorescencja polega na obserwacji wzbudzenia elektronów wynikającego z procesu tegoż oświetlenia.

W laboratoriach rutynowych stosujemy np. do obserwacji prądków gruźlicy, bądź w serologii kiły. W laboratoriach badawczych np. w cytodiagnostyce.
W laboratoriach metalograficznych środki fluorescencyjne po umieszczeniu na powierzchni preparatu i po procesie polerowania, mogą ujawnić np. mikropęknięcia.

Powiększenie mikroskopu.
Powiększenie mikroskopu realizowane jest poprzez obiektyw, który realizuje w tubusie mikroskopu obraz rzeczywisty, który  jest powiększony następnie przez okular dający obraz pozorny . Powstały dzięki takiemu układowi obraz  jest wynikiem, który obserwujemy.

Powiększenie, które uzyskujemy w układzie obiektyw – okular możemy w najprostszy sposób wyliczyć z wzoru:

M = M_ob x M_oc

gdzie :

M     -      powiększenie mikroskopu ( magnification ),
M_ob.  -     powiększenie obiektywu,
M_oc   -      powiększenie okularu.

Powiększenie użyteczne mikroskopu.
Wartość ta mówi nam o powiększeniu nie przekraczającym i wynikającym z możliwiości rozdzielczej zastosowanej w danej chwili optyki.

Powiększenie puste ( liniowe ).
Powiększenie puste to powiększenie obrazu większe od możliwości rozdzielczości optyki.
Obraz w taki sposób powiększony nie wnosi nowych informacji ( szczegółów wynikających z rozdzielczości ), a jest tylko zwyczajnie większy.

Apertura numeryczna.
Apertura numeryczna ( NA – numerical aperture ) związana jest z realizacją rozdzielczości.
Jest to podwójny kąt wyznaczany osią optyczną i opisije się ją wzorem:

NA = n sinθ

gdzie:
n - współczynnik załamania światła w danym ośrodku, medium ( powietrze, olejek immersyjny ),
θ - połowa maksymalnego kąta, pod którym światło może padać z punktu na przyrząd bez wewnętrznego odbicia.

Czym większa wartość NA, tym większa realizowana rozdzielczość. Większa rozdzielczość wiąże się jednak z mniejszą odległością roboczą oraz mniejszą głębią ostrości.

Rozdzielczość optyczna.
Rozdzielczość optyczna zależy głównie od zastosowanych obiektywów i posiada ograniczenia związane z prawami fizyki.
Ograniczeniem jest zakres długości fal światła widzialnego przez człowieka a nie możliwości konstrukcyjnych mikroskopu.

Rozdzielczość optyczna: 

1/d = λ / 2*NA

Zależność  rozdzielczości optycznej od długości fal światła widzialnego wyraża się wzorem :

1/d = λ / 2*n*sinα 

 gdzie :

d    -    najmniejsza odległość między dwoma punktami możliwa do ujrzenia w mikroskopie,
α    -     kąt aperturowy obiektywu,
n    -    współczynnik załamania światła w danym medium,
λ    -      długość fali świetlnej.

Po wstawieniu wartości otrzymamy w zależności od wykorzystanej techniki obserwacji
rozdzielczość mikroskopu optycznego 0,4-0,5 μm.

Niektóre techniki ( mikroskopia konfoklana ) pozwalają na uzyskanie rozdzielczości do 120 nm.

Odległość robocza.
Odległość robocza WD ( working dystance ) obiektywu to dystans pomiędzy czołem obiektywu i powierzchnią obserwowanego preparatu. Zależna jest od apertury numerycznej i rozdzielczości. Duże apertury numeryczne NA determinują zazwyczaj małe odległości robocze. Obiektywy o dużych odległościach roboczych warto stosować w sytuacjach agresywnych substancji związanych np. z wybarwianiem, czy trawieniem preparatów oraz gdy chcemy dokonywać manipulacji na samej próbce.

System oświetlenia.

Obecnie stosuje się dwa systemy :
- krytyczny – oświetlenie najprostsze stosowane w modelach edukacyjnych i rutynowych. Charakteryzuje się umieszczeniem źródła światła najczęściej
bezpośrednio pod kondensorem i zastosowaniu jednej, lub dwóch soczewek. Często stosuje się jedną tylko przesłonę aperturową w kondensorze.

-  system oświetlenia Koehlera stosowany w modelach rutynowych i badawczych,  to rozwiązanie charakteryzuje się wyprowadzeniem żarówki halogenowej poza ramę mikroskopu oraz możliwości centrowania układu z wykorzystaniem przesłon; polowej i aperturowej.

Rezultatem oświetlenia Kohlera jest precyzyjny, równomierny rozkład wiązki światła oświetlającej preparat oraz nie nagrzewanie preparatu.
istnieją także mieszane systemy oświetlenia.

Autor: K.J