Wykorzystanie polaryzacji jako techniki mikroskopii świetlnej pozwala uzyskać dodatkowy rodzaj informacji o próbce – standardowo niewidoczny w jasnym polu. Stosując tę metodę mikroskopowania rzadziej mówimy o wielkości i kształcie struktury, rozdzielczości czy nawet konkretnym wybarwieniu. W przypadku próbek przezroczystych obserwacje w polaryzacji mają na uwadze głównie jedną właściwość: potencjalną dwójłomność próbki wywołaną jej strukturą.

Dwójłomność

Dwójłomność jest zjawiskiem powszechnym, występującym zarówno w przyrodzie, jak i w materiałach wytworzonych przez człowieka. Ziarna skrobi, włókna, kryształy i minerały, płyty z tworzyw sztucznych i elementy odlewane ciśnieniowo - podstawa fizyczna jest zawsze taka sama: anizotropowa (czyli zależna od kierunku) geometria struktury próbki wpływa na prędkość światła i kierunek jego oscylacji. Jako przykład podajmy anizotropowy kryształ, jakim jest kalcyt. Jeżeli spojrzymy przez przezroczystą płytkę kalcytową na druk to zauważymy, że litery są widoczne podwójnie. Wynika to z naturalnej dwójłomności kalcytu – wiązka światła przebiegając przez kwarc rozdziela się na dwie wiązki o dwóch prędkościach, w związku z tym widzimy dwa obrazy wydrukowanych liter.

Standardowo w obserwacjach mikroskopowych w jasnym polu dwójłomność drobnych struktur nie jest widoczna. Aby w pełni wydobyć z obrazu informację o anizotropowości badanej próby, należy oświetlić ją światłem spolaryzowanym. 

Czym jest polaryzacja

Aby dobrze zrozumieć czym jest polaryzacja i w jaki sposób działa dwójłomność, należy rozpatrzyć światło jako falę elektromagnetyczną, której kierunek rozchodzenia się jest prostopadły do kierunku drgań: 

Prędkość światła w próżni jest stała i wynosi c0= 299.792.458 m/s. Ta stała wartość jest związana ze współczynnikiem załamania w próżni, który wynosi n=1. Jeżeli światło przechodzi przez medium, którego współczynnik załamania jest wyższy od 1, prędkość światła zmniejsza się. 

gdzie:
n – współczynnik załamania światła danej substancji
c0 – prędkość światła w próżni
c – prędkość światła w danej substancji.  

Dla przykładu, w wodzie (n=1,33) prędkość światła wynosi c=c0/1,33=22540785 m/s. Współczynnik załamania mówi nam, o ile dane medium spowalnia światło: możemy zatem przyjąć go jako wyznacznik wartości „gęstości optycznej” materiału. Poniżej krótka lista: 

Zwróć uwagę na fakt, że współczynnik załamania olejku immersyjnego i szkła są zbliżone. Olejek immersyjny jest stosowany w mikroskopii świetlnej, aby zwiększyć współczynnik załamania w przestrzeni pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a soczewką czołową obiektywu. Dzięki wysokiemu współczynnikowi załamania więcej światła trafia do obiektywu, a co za tym idzie – zdolność rozdzielcza obiektywu zwiększa się.  

Ośrodki, w których prędkość światła pozostaje niezmienna w zależności od kierunku, nazywamy izotropowymi. Z kolei w ośrodkach anizotropowych wyróżniamy dwa kierunki propagacji światła o dwóch różnych współczynnikach załamania. Wróćmy na chwilę do przykładu z kalcytem, który jest kryształem jednoosiowym. Podwójny obraz uzyskany po przejściu przez płytkę kalcytową jest wynikiem współistnienia dwóch różnych współczynników załamania światła, wpływającego na rozdzielenie się jednego promienia światła na dwa promienie: szybki (inaczej zwany zwyczajnym; n1) oraz wolny (inaczej zwany nadzwyczajnym; n2). Promień nadzwyczajny jest załamywany mocniej niż zwyczajny, w związku z tym powstają dwa obrazy.  Ośrodki, w których prędkość światła pozostaje niezmienna w zależności od kierunku, nazywamy izotropowymi. Z kolei w ośrodkach anizotropowych wyróżniamy dwa kierunki propagacji światła o dwóch różnych współczynnikach załamania. Wróćmy na chwilę do przykładu z kalcytem, który jest kryształem jednoosiowym. Podwójny obraz uzyskany po przejściu przez płytkę kalcytową jest wynikiem współistnienia dwóch różnych współczynników załamania światła, wpływającego na rozdzielenie się jednego promienia światła na dwa promienie: szybki (inaczej zwany zwyczajnym; n1) oraz wolny (inaczej zwany nadzwyczajnym; n2). Promień nadzwyczajny jest załamywany mocniej niż zwyczajny, w związku z tym powstają dwa obrazy.  

Różnica współczynników promienia zwyczajnego i nadzwyczajnego (n2-n1) jest stała i wpływa bezpośrednio na parametr zwany opóźnieniem lub retardacją (?, jednostka: nm). Im wyższa dwójłomność, tym bardziej fala świetlna promienia nadzwyczajnego jest opóźniona względem promienia zwyczajnego. Właśnie dlatego retardacja zależy od grubości próbki dwójłomnej. Wartość retardacji wpływa na wizualny obraz mikroskopowy obiektu w świetle spolaryzowanym: dzięki temu jesteśmy w stanie zbadać materiał, z jakiego wykonane są kryształy i minerały.

Analizator i polaryzator

Aby zauważyć zmiany w obrazie mikroskopowym, należy przygotować mikroskop z zestawem do polaryzacji. Taki zestaw składa się z dwóch filtrów zwanych kolejno polaryzatorem i analizatorem. Filtr polaryzacyjny przepuszcza tylko jeden kierunek drgań naturalnie niespolaryzowanego światła, którego drgania odbywają się we wszystkich kierunkach. Światło po przejściu przez polaryzator jest spolaryzowane liniowo.

Polaryzator umieszczany jest na drodze światła pomiędzy źródłem światła a próbką – zazwyczaj na oświetlaczu lub w uchwycie pod kondensorem. Analizator umieszczamy po przejściu światła przez obiektyw – zazwyczaj jest to szczelina nad misą rewolwerową lub gniazdo w głowicy. Wiele mikroskopów transmisyjnych ma możliwość doposażenia w filtry polaryzacyjne.

Analizator ustawiamy pod kątem 90 stopni względem polaryzatora obracając nim. Jeżeli nie mamy łatwego dostępu do analizatora, możemy obracać polaryzatorem. Widząc ostry obraz preparatu w okularach obracamy filtrem do momentu uzyskania ciemnego tła – w takim ustawieniu mówimy o polaryzatorze i analizatorze, że są ze sobą skrzyżowane. Przy skrzyżowanych filtrach polaryzacyjny widzimy w obrazie głównie wpływ struktur anizotropowych.

Próbka wykazująca dwójłomność – dopuszczającą dwa kierunki oscylacji – wymusi zmianę kierunku oscylacji światła spolaryzowanego liniowo. Innymi słowy, zmieni się jego stan polaryzacji. Światło po wejściu do próbki „rozdzieli się” na promień zwyczajny i nadzwyczajny wywołując retardację. Część tego światła o określonym kierunku drgań zostaje później przepuszczona przez analizator.

Analizator wymusza interferencję promienia zwyczajnego i nadzwyczajnego. W rezultacie kolor „interferencyjny” jest bezpośrednio związany z wartością retardacji wywołanej przejściem światła przez dwójłomną próbkę. Większość retardacji jest mniejsza od 300 nm, wywołując czarno/biały obraz. Wyższe retardacje wywołują kolory. W przypadku, gdy kierunek propagacji szybkiego/wolnego promienia w próbce jest zorientowany zgodnie z kierunkiem przepuszczania drgań przez polaryzator, efekt wizualny wywoływany przez dwójłomność nie będzie widoczny. Między innymi dlatego w mikroskopach polaryzacyjnych stosuje się stoliki obrotowe umożliwiające obrót próbki.

Do pracy w polaryzacji przeznaczone są specjalne obiektywy polaryzacyjne oznaczone literą P po wartości N.A. Wykonane są ze szkła odprężonego, które mogłoby wpływać na rozjaśnienie tła w obrazie przy skrzyżowanych filtrach polaryzacyjnych. Używanie obiektywów polaryzacyjnych jest zalecane, ale nie konieczne do pracy w polaryzacji.

Do pomiarów niewielkich wartości retardacji w celu oszacowania chemicznego składu próbki niezbędne są kompensatory oraz stolik obrotowy. Kompensatory wytworzone z materiałów dwójłomnych umożliwiają zwiększenie retardacji do wartości powyżej 300 nm. Do tego typu badań warto zaopatrzyć się w profesjonalny mikroskop polaryzacyjny.

Zobacz w naszym katalogu: Mikroskopy polaryzacyjne

Na podstawie artykułu "About Polarization" opublikowanego na blogu tematycznym firmy MOTIC (https://moticeurope.blogspot.com/2018/02/about-polarization.html).